Холандски изследователи комбинират CRISPR и биолуминесценция в експериментален тест заинфекциозни заболявания

Новоразработен нощен протеин може да ускори и опрости диагностицирането на вирусни заболявания, според изследователи от Холандия.
Тяхното проучване, публикувано в сряда в ACS Publications, описва чувствителен, едноетапен метод за бързо анализиране на вирусни нуклеинови киселини и техния външен вид с помощта на светещи яркосини или зелени протеини.
Идентифицирането на патогени чрез откриване на техните отпечатъци от нуклеинова киселина е ключова стратегия в клиничната диагностика, биомедицинските изследвания и мониторинга на безопасността на храните и околната среда.Широко използваните тестове за количествена полимеразна верижна реакция (PCR) са силно чувствителни, но изискват сложна подготовка на пробите или интерпретация на резултатите, което ги прави непрактични за някои здравни заведения или заведения с ограничени ресурси.
Тази група от Холандия е резултат от сътрудничеството между учени от университети и болници за разработване на бърз, преносим и лесен за използване метод за диагностика на нуклеинова киселина, който може да се прилага в различни условия.
Те бяха вдъхновени от проблясъци на светулки, сияния на светулки и малки звезди от воден фитопланктон, всички захранвани от феномен, наречен биолуминесценция.Този ефект на светене в тъмното се причинява от химическа реакция, включваща протеина луцифераза.Учените включиха луциферазни протеини в сензори, които излъчват светлина, за да улеснят наблюдението, когато намерят цел.Въпреки че това прави тези сензори идеални за откриване на място, в момента им липсва високата чувствителност, необходима за клинични диагностични тестове.Въпреки че методът за редактиране на ген CRISPR може да предостави тази възможност, той изисква много стъпки и допълнително специализирано оборудване за откриване на слаб сигнал, който може да присъства в сложни, шумни проби.
Изследователите са открили начин да комбинират протеин, свързан с CRISPR, с биолуминисцентен сигнал, който може да бъде открит с обикновена цифрова камера.За да се уверят, че има достатъчно РНК или ДНК проба за анализ, изследователите извършиха рекомбиназна полимеразна амплификация (RPA), проста техника, която работи при постоянна температура от около 100°F.Те разработиха нова платформа, наречена Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), в която двата протеина CRISPR/Cas9 са специфични за различни съседни части на вирусния геном, всяка с уникален луциферазен фрагмент, прикрепен към тях отгоре.
Когато специфичният вирусен геном, който изследователите изследват, е налице, два протеина CRISPR/Cas9 се свързват с целевата последователност на нуклеинова киселина;те стават в непосредствена близост, което позволява на непокътнатия луциферазен протеин да се образува и излъчва синя светлина в присъствието на химически субстрат..За да отчетат субстрата, консумиран в този процес, изследователите са използвали контролна реакция, която излъчва зелена светлина.Епруветка, която променя цвета си от зелен на син, показва положителен резултат.
Изследователите тестваха своята платформа, като разработиха теста RPA-LUNAS, който откриваSARS-CoV-2 РНКбез досадно изолиране на РНК и демонстрира своята диагностична ефективност върху проби от назофарингеален тампон отCOVID 19пациенти.RPA-LUNAS успешно откри SARS-CoV-2 в рамките на 20 минути в проби с РНК вирусен товар от едва 200 копия/μL.
Изследователите вярват, че техният анализ може лесно и ефективно да открие много други вируси.„RPA-LUNAS е привлекателен за тестване на инфекциозни заболявания на място“, пишат те.